核酸是一種生物分子，包括DNA和RNA，是生命體內(nèi)儲(chǔ)存和傳遞遺傳信息的基本分子。DNA主要集中在細(xì)胞核、線粒體和葉綠體中，而RNA則主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。核酸提取是指從復(fù)雜體系中實(shí)現(xiàn)核酸的分離和純化，以便進(jìn)行相應(yīng)的科學(xué)研究和實(shí)際應(yīng)用。 核酸提取純化原則 1、保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性； 2、排除其它核酸分子的污染（如提取DNA時(shí)排除RNA的干擾）； 3、核酸樣品中不存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子； 4、盡可能降低其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染。 核酸提取基本步驟 1、裂解細(xì)胞，釋放核酸：使用裂解液破壞樣品細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而使樣品中的核酸游離在體系中； 2、核酸的分離與純化：將與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子和其他不需要的核酸分子去除； 3、核酸富集與洗脫：采用洗脫液處理吸附有核酸的吸附物，富集得到目的核酸。 常用核酸提取方法 1、溶液法 是比較經(jīng)典的提取方法，苯酚是蛋白質(zhì)的變性劑，反復(fù)抽提，使蛋白質(zhì)變性，SDS將細(xì)胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質(zhì)或多肽或小肽分子，變性降解核蛋白，使DNA從核蛋白中游離出來。而DNA易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。蛋白質(zhì)分子表面帶有親水基團(tuán)，也容易進(jìn)行水合作用，并在表面形成一層水化層，使蛋白質(zhì)分子能順利地進(jìn)入到水溶液中形成穩(wěn)定的膠體溶液。當(dāng)有機(jī)溶液存在時(shí)，蛋白質(zhì)的這種膠體穩(wěn)定性遭到破壞，變性沉淀。離心后有機(jī)溶劑在試管底層(有機(jī)相)，DNA存在于上層水相中，蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間。離心分層后取水層，經(jīng)過多次重復(fù)操作，并合并含核酸的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇/異丙醇來沉淀核酸，然后再進(jìn)行分離和純化、溶解后即可得到高純度核酸。 溶液法成本低，但存在有毒試劑，影響操作人員健康，而且較為繁瑣，操作時(shí)間長(zhǎng)，提取的核酸質(zhì)量也較為一般。 2、柱提法 利用特殊硅基質(zhì)吸附材料，能夠特定吸附核酸，而蛋白質(zhì)、多糖、脂類等基本不吸附，被離心沉淀與核酸分離的原理。硅膠膜表面存在的硅醇基團(tuán)呈弱酸性，水化后帶負(fù)電。樣品裂解后，如果溶液中存在一定濃度的陽離子時(shí)，會(huì)中和DNA硅醇基團(tuán)之間的表面負(fù)電荷，從而使DNA能夠牢固地吸附在硅膠膜表面。而當(dāng)處于低鹽水溶液時(shí)，DNA磷酸基團(tuán)和硅膠膜的硅醇基團(tuán)之間存在排斥，硅膠膜就會(huì)把DNA釋放出來，從而達(dá)到分離純化核酸的目的。 柱提法試劑盒價(jià)格較低，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，在市面上應(yīng)用較為廣泛。但是其對(duì)樣本起始量會(huì)有一定的限制，當(dāng)投入樣本過多（如大塊組織）可能導(dǎo)致吸附膜堵塞，同時(shí)由于需要反復(fù)離心不便于高通量、自動(dòng)化操作等。 3、磁珠法 與硅基離心柱原理類似，磁性顆粒活性基團(tuán)在一定條件下可與核酸特異性結(jié)合和解離，先使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)借由解離的鹽離子（如Na+）與磁珠表面羧基形成離子橋，使DNA被特異性吸附到羧基磁珠表面，利用磁珠的磁性，可通過外加磁場(chǎng)進(jìn)行收集洗脫，獲得質(zhì)量較好的核酸模板。 磁珠法不需要離心、無需加入多種試劑，操作簡(jiǎn)單，符合核酸自動(dòng)化提取要求，但是成本較高。 蛋白酶K在核酸提取中的作用 蛋白酶K是一種從白色念珠菌分離出來的強(qiáng)力蛋白溶解酶，具有很高的比活性。蛋白酶K能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，分離DNA與蛋白質(zhì)，使DNA能夠更好被提取。還可降解RNA水解酶（RNase）活性，抑制RNase水解模板的RNA，在RNA的提取和檢測(cè)過程中起到不可或缺的作用。而RNA極不穩(wěn)定、易于被廣泛存在的RNase降解，因此利用蛋白酶創(chuàng)造一個(gè)無RNase的環(huán)境、嚴(yán)格防止RNase污染是成功提取RNA的關(guān)鍵。 核酸提取的下游應(yīng)用包括 1、PCR擴(kuò)增：從提取的DNA或RNA中擴(kuò)增目的片段，用于分子診斷、分子生物學(xué)研究、藥物研發(fā)、病毒檢測(cè)等。 2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR：用于定量檢測(cè)DNA或RNA的含量，可以用于基因型檢測(cè)、差異表達(dá)分析、細(xì)胞數(shù)量、病毒載量、轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)等。 3、基因測(cè)序：對(duì)提取的DNA或RNA進(jìn)行測(cè)序，用于腫瘤基因組學(xué)、新生兒篩查、精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和基因診斷等。 4、蛋白質(zhì)研究：用提取的DNA或RNA表達(dá)翻譯合成蛋白質(zhì)，用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能等。 這些下游應(yīng)用可以幫助我們更深入地研究生物樣本中的DNA或RNA，并揭示它們?cè)谏飳W(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的重要作用。 沃森生物試劑推薦
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